АЗУ(В) in vitro и in vivo
Jun. 27th, 2021 06:50 pm![[personal profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/user.png){kind=small}
chuka_lisСтатья, довольно большая, и хорошо охватившая проблему АЗУ при ковиде.Тк материала много, потребует усилий и дополнительного структурирования, если кто захочет разобраться поподробнее. Я приведу ниже, после моего обобщения, дискуссию, тк в ней обговариваются основные моменты.
Что сделали авторы:
Поскольку известно, что ответ иммунитета поликлональный, и когда ему представлен целый микроорганизм, или хотя бы его белок (допустим), содержащий множественные антигенные эпитопы (небольшие участки этого белка, с которым специфические антитела свяжутся и подойдут как ключ к замку)- то в результате такой встречи будут вырабатываться разные антитела, к разным эпитопам (иногда заходящим друг на дружку участкам) белка, и у одного человека, и у разных людей, причем еще и в разном количестве. И, так же, сила связывания антител с этими эпитопами будет разная, и эффективность связывания (нейтрализация проникновения патогена в клетку) -тоже.
Так же, есть данные, что некоторые антитела, из производимых, для некоторых болезней, могут усиливать заражения клеток вирусом в эксперименте или при реальной инфекции. Эффект АЗУИ-антитело заивсимое усиление инфекции. Или АЗУВ (воспаления).
Авторы решили проверить, как будут работать антитела (группа примерно в 1700) переболевших, предположительно, похожих на выработавшиеся в результате иммунизации к шипиковому белку, в пробирке и на животной модели. Будут ли они эффективно помогать? будут ли усиливать инфекцию? Как вообще они себя видут на молекулярном и биофизичеком уровне, соединяясь с антигеном, есть ли между ними принципиальные отличия, чтобы можно было как то отличить, или повлиять, итп?
Из этой большой выборки отобрали 187 антител, теоретически "более рабочих", чтоб были к эпитопам шипика.
Среди 81 антител к РСЧ шипика (из этой выборки в 187), нейтрализующим действием обладали 44. То есть больше половины.
Авторы отобрали 100 разных антител IgG1 к шипику (не только к РСЧ), и проверили, могут ли они вызывать АЗУИ in vitro.
Под АЗУИ тут имеется ввиду прямое значение- проникать внутрь клетки, не содержащей основного рецептора АСЕ2 и нужной трансмембранной протеазыTMPRSS2, а через антительный рецептор, содержащейся на ней ( Fc receptor - FcγR (в нескольких видах- (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb or FcγRIII, он, обычно на иммунных клетках, помогающих утилизировать меченный антителом патоген. но через него вирус в составе комплекса АгАт может проникать в модельные клетки и размножаться там).
Таких оказалось три, связывающихся с FcγRI, и пять, соединяющихся с FcγRIIb. За проникновение в клетки были ответственны именно "рецепторные" части антител (Fc). Потом проверили, обладают ли эти "усиляющие инфекцию антитела к РСЧ- нейтрализующим эффектом. Оказлось- да.
Характерно, что все эти АЗУ-антитела были из группы к РСЧ шипика.
Так же авторы проверили 41 антитело к N(амино)-концу шипика коронавируса. Почему к нему? Думаю, потому что антитела при иммунизации могут образовывастья не только к РСЧ, а к S1 субъединице вируса, S2 и N-концу, и есть исследование, показавшее- что к амино-концу вырабатывается удивительно много антител (почему-то), 84%, и они, при этом, порой тоже обладают нейтрализующей активностью (мешают вирусу связываттся с АСЕ2).
Как выглядит шипик для антител
10 антител з 41 оказались способны нейтрализовать проникновение вируса (препятствовать соединению вируса с АСЕ2). Так же, в этой группе было 5 антител, не обладающих нейтрализирующим действием, но способствующим АЗУИ на культуре клеток. Интересно, что эти последние 5 антител могли проникать только в клетки с АСЕ2 рецепторами, в отсутствии FcγR - просто в присутствии этих антител заражаемость культур вирусом (при всех прочих равных) увеличивалась в полтора- три раза (почему-не совсем понятно, но, возможно, связывание с антителом как то улучшало конформацию и облегчало связываение с АСЕ2 или работу протеазы).
Часть из антител к N-концу тоже оказалась способной вызывать АЗУИ с использованием Fc.
По антителам к РСЧ- они могли обладать нейтрализующим эффектом, усиляющим инфекцию эффектом, или обоими сразу.
Для антител к N-концу : они обладали либо нейтрализующим, либо АЗУ эффектом.
Далее авторы сравнили "усиляющие инфекцию" нейтрализующие антитела к РСЧ, и просто нетрализующие антитела к РСЧ. Оказалось, что они не отличаются ни по силе связывания (афинность), ни по местам связывания (эпитопы), ни по блокировке зон. Геометрически, они тоже связывались примерно одинаково (вертикально, параллельно оси тримера S белка). Блокировка РСЧ у некоторых антител была просто потому, что они физически перекрывали РСЧ, а у других- нет (визуально РСЧ был свободен).
Небольшая разница, можно сказать была только в том, что- нейтрализующие антитела своими "хвостами" (что связываются с рецептором иммунной клетки) были чаще направлены в сторону от вирусной оболочки, а "усиляющие"- слегка в сторону вируса. Но не все. В целом же, среди всех антител с потенциалом АЗУ, их рецепторные хвосты чаще были направлены в сторону вируса.
Любопытно, что часть из этих РСЧ антител реагировала перекрестно и с РСЧ вируса САРС1, и летучих мышей, и панголина.
По антителам к N-концу- они обладали чуть более сильной афинностью, особенно одно из усиляющих заражение.
И 5 из них, как оказалось, обладали вполне эффективной нейтрализующей активностью: не смотря на то, что вроде бы и не к РСЧ, тем не менее, в ними, сидящими на шипике, вирус не мог соединиться с АСЕ2.
Так же, авторы проверили- а не мешают ли все эти антитела друг другу. Выяснилось, что не особо. Если есть разные антитела, то будут садиться каждый на свой участок, и все. Если вместе с нейтрализующим(и) сядет и антитело для АЗУ - эффект АЗУ может реализоваться. На 1 шипик может "напасть" сразу несколько нейтрализующих антител.
Будет ли "предпочтение" при связывании? Например, если есть просто нейтрализующие IgG, и нейтрализующие с эффектом АЗУ - то вдруг вторые окажутся резвее?
Нет, процесс вероятностный, тк все прочие у них примерно одинаковые. А так, чтоб "доминировали" нейтрализующие IgG с эффектом АЗУ (ну и приводили к дальнейшей патологии)- и гарантирваоно заняли место на шипике, то их должно быть в системе, примерно в 1000 раз больше, чем других, как покаазло моделирование in vitro.
Что, в общем, не может не обнадеживать.
Потому что смотрим- из 187 типов антител IgG, только 15 оказались способными на АЗУИ. А нейтрализующим эффектом обладали 54 антитела.
Авторы пошли дальше.
Они взяли антитела, которые обладают способностью к АЗУИ, наразмножали их, и ввели животным. В таких количествах, чтобы "сымитировать" натуральный иммунитет, который мог бы возникнуть с эфектом АЗУ у привитых.
Чтобы проверить, на сколько ситуация in vivо будет похожа на in vitro.
Как модели они использовали стареющих мышей, которых заразили модифицирванным под них коронавирусом САРС2, и макак, для котрых подошел обычный штамм.
Оказалось, что мыши, у которых были высокие концентрации антитела N-концу с потенциалом АЗУИ, введенного за 12 часов до инфекции, болели точно так же (по симптомам), как и мыши без этих антител (контролю вводили антитела против гриппа).
Опытные мыши очищались от вируса быстрее, у них было меньше повреждений в легких, меньше вирусной РНК в легких, и выживали лучше ( в контроле умерло 2 мышки из 9 на 4 день, когда проверяли что там с легкими, а в опыте все были 10 живы). Так что даже не-нейтрализующее антитело к N-концу шипикового белка помогло им справляться с инфекцией, и не проявило свою способность к АЗУИ на животной модели.
Далее, это же антитело проверили на макаках (заразили интраназально на 3 день после введения антител), притом сравнили и с положительным контролем- которому ввели другое антитело N-концу шипика, обладающее только нейтрализующим эффектом.
У макак взяли кровь, определили, что титр человеческих антител к коронавирусу на 2 день был приличный (11 to 238 μg/mL). Болезнь у 4 макак с АЗУ-антителом протекала так же, как и у контроля (просто зараженных ковидом, с антителом к гриппу). А у одной было тяжелое течение.
То есть, в 20% наблюдались патологичсекие реакции в легких (отечность, повышенные количества макрофагов М2 типа и цитокинов), но поскольку у них обнаружилась макака с подобными проявлениями и в контрольной группе (где был просто ковид, а антител к коронавирусу не вводили), то авторы относят призошедшее к редкой индивидуальной реакции (хотя я б не была так уверенна).
У всех макак, которые получили просто нейтрализующее антитело, было меньше поражений в легких, и меньше вирусной РНК в образцах. АЗУ-антитело к них, в отличие от мышей, не показало особой эффективности против вируса.
Чтобы проверить, нет ли тут дозозависимости, группе макак ввели и в 3 раза повышенную дозу тех же АЗУ-антител. Отрицательных эффектов вроде АЗУ отмечено не было, зато эта доза антител уже подавляла вирус в мазках и выделениях. Только картина течения болезни была все такая же- как и в контроле, и при более низкой дозе АЗУ-антител.
Так что авторы сделали вывод, что такие антитела не проявляют свой потенциал к АЗУ (доказанный in vitro) при реальной болезни. Так что не стоит его опасаться.
Далее авторы проверили подобным образом и АЗУ-антитела к РСЧ. Они введили годовалым мышкам нейтрализующее антитело к РСЧ, или нейтрализующее антитело к РСЧ с АЗУ потенциалом, или даже оба этих антитела вместе.
Результат вышел выше всех похвал- мышки болели слабо-выраженно, поражения в легких были минимальные, и вообще, вируса было мало, а у некоторых через 2 суток вообще в легких не определялся. Единственное, думаю, что 2 дня после инфекции это было рановато все смотреть в легких- лучше б было 4, как в предыдущем варианте, и мне не совсем понятна логика.
Потом авторы проверили (на мышках же) нейтрализирующие АЗУ-антитела к РСЧ, которые показали кросс-реактивность с другими коронавирусами, и способность проникать в клетку через FcγR (на культуре клеток). Они вводили им эти антитела за 12 часов до инфекции мышиным вариантом ковида, или 12 часов после.
Те, кому ввели антитела до заражения- показали чистые легкие, а у контроля легкие были завирушены. Если антитела вводились после инфекции- то в зависимости от вида антитела они снижали завирушенность легких в 2-10 раз. АЗУ-потенциал этих антител не реализовался на мышиной модели, а наоборт, они показали свое защитное действие.
Все нейтрализующие АЗУ-антитела, проверенные на мышках (4 вида) к РСЧ проверили так же и на макаках. Через 2 дня после введения человеческих антител (10 мкг на кг) их уровни в крови макак были 11 -228 μg/mL.
Нейтрализирующий эффект присутствовал, и широко вариьировал. 3 типа антител показали защитный эффект ( у животных было меньше поражений в легких, и мало вирусной РНК в верхних инижних дыхательных путях, по сравнению с контролем). Одно из антител (более слабое с точки зрения нейтрализации in vitro)- не повлияло на количество вируса, но защитный эффект тоже был у части макак. 3 из этой группы имели поражения в легких такого же уровня или более, как и контроль (без нейтрализующих антител к коронавирусу). У этих макак были инфильтрации макфроагов в легкие, но не было поражений сосудов в легких, и было чуть меньше вируса. В общем, у 2 была пневмония, у одной ТОРС.
Но это 3 макаки из 31, и, возможно, такая реакция поясняется их индивидуальными особенностями- тк вируса у них в системе все же было обнаружено меньше, чем в контроле.
Так что, с точки зрения авторов- даже антитела, показывающие АЗУ-потенциал в пробирке, в организме, скорее всего, проявят себя именно как защитники- в большинстве случаев они нейтрализуют вирус эффективно, и уменьшают симптомы болезни.
С моей колокольни- все же, у них в эксперименте реализовался шанс, для некоторых из этих АЗУ-антител. На макаках в одной серии ( с АЗУ-антителом камино-концу шипика)- 20%, в другой (с АЗУ-антителом к РСЧ) - если брать всю группу в 31 животное- то это 7% среднетяжелой (пневмония, наверное-не запущенная) и 3%- ТОРС.
Методика там где-то отдельно,потому точное время, когда все это наблюдалось-проверялось у макак, не скажу.
Только вот в отличие от болезни и естественного иммунитета- который будет усиливаться по ходу повторного столкновения с антигеном (тк будут активироваться клетки, производящие антитела и цитокины)- введенные человеческие антитела со временем просто вымываются, и сами по себе, и ввиду Ат-Аг реакций и дальнейшего фагоцитоза.Так что в реале может быть несколько другая картина при инфекции, чем у обезьян.
Так же, средне-тяжелые и тяжелые случаи ковида (когда есть поражения легких игоспитализация)- тоже где то около 10%, и среди всех случаев, критические и тяжелые- тоже не то чтобы большой % (если предположить что результат смерть- то 2%, в среднем). Так что это все цифры на животных- похожих порядков, и может быть, как раз реализация вероятности АЗУ, в том числе.
Возможно, авторы словили и не АЗУИ, а АЗУВ (воспаления)- ведь одни животные, все же, болели тяжелее других. А группы не слишком велики.
Разумеется, индивидуальные особенности иммунитета важны, но и я так вижу, что иногда шанс на АЗУ на животной модели может реализоваться (хоть и не так гарантированно, как в пробирке).
При этом - не забываем о главном результате работы- что антитела, даже с АЗУ потенциалом, борются с вирусом, и гуморальный иммунитет к коронавирусу помогает, примерно в 90% случаев.
Абстракт
SARS-CoV-2 neutralizing antibodies (NAbs) protect against COVID-19. A concern regarding SARS-CoV-2 antibodies is whether they mediate disease enhancement. Here, we isolated NAbs against the receptor-binding domain (RBD) and the N-terminal domain (NTD) of SARS-CoV-2 spike from individuals with acute or convalescent SARS-CoV-2 or a history of SARS-CoV-1 infection. Cryo-electron microscopy of RBD and NTD antibodies demonstrated function-specific modes of binding. Select RBD NAbs also demonstrated Fc receptor-γ (FcγR)-mediated enhancement of virus infection in vitro, while five non-neutralizing NTD antibodies mediated FcγR-independent in vitro infection enhancement. However, both types of infection-enhancing antibodies protected from SARS-CoV-2 replication in monkeys and mice. Nonetheless, three of 31 monkeys infused with enhancing antibodies had higher lung inflammation scores compared to controls. One monkey had alveolar edema and elevated bronchoalveolar lavage inflammatory cytokines. Thus, while in vitro antibody-enhanced infection does not necessarily herald enhanced infection in vivo, increased lung inflammation can occur in SARS-CoV-2 antibody-infused macaques.
Дискуссия:
Here, we demonstrated SARS-CoV-2 RBD and NTD antibodies can increase infection in vitro, but either protect or do not increase coronavirus replication in mouse and monkey models in vivo. However, increased lung inflammation was observed infrequently in SARS-CoV-2 antibody-treated macaques despite having low or undetectable lung viral antigen. In three of 31 monkeys administered RBD or NTD antibodies that mediated infection enhancement in vitro, lung inflammation scores were greater than in control IgG-infused monkeys. One of these three macaques had alveolar edema and elevated BAL cytokine levels compatible with acute respiratory syndrome, while the other two monkeys with high lung inflammation scores did not show edema nor BAL inflammatory cytokines. Thus, only one antibody-infused monkey had severe lung inflammation.
Notably, we observed two different types of in vitro infection enhancement. First, RBD antibodies mediated classical antibody-dependent enhancement that required FcγRs and antibody Fc for virus uptake (Lee et al., 2020). Previous studies have demonstrated that uptake of MERS-CoV or SARS-CoV has mostly been mediated by FcγRIIa on the surface of macrophages (Bournazos et al., 2020; Wan et al., 2020; Yip et al., 2016). In contrast to SARS-CoV and MERS-CoV infection enhancing antibodies, we identified SARS-CoV-2 RBD antibodies utilized FcγRIIb or FcγRI. Thus, different FcγRs can mediate SARS-CoV and MERS-CoV in vitro infection enhancement compared to SARS-CoV-2 in vitro infection enhancement. Second, non-neutralizing NTD antibodies mediated FcγR-independent infection enhancement in two different FcγR-negative, ACE2-expressing cell types. The mechanism of FcγR-negative in vitro enhancement remains unclear, but one hypothesis is the possibility of antibody modulation of S protein conformation because of the requirement for ACE2 expression on target cells. In NSEM studies, NTD antibodies preferentially bound to S in a 3-RBD-down conformation. One study has reported that binding of select NTD antibodies to S enhances S binding to ACE2 (Liu et al., 2020b). Whether S protein has different entry kinetics or higher affinity for ACE-2 when liganded to infection-enhancing antibody DH1052 will be a focus of future studies.
Previous studies with vaccine-induced antibodies against SARS-CoV-1 have also shown in vitro FcγRII-dependent infection enhancement, but no in vivo infection enhancement in hamsters (Kam et al., 2007). Macrophages and other phagocytes are the target cells that take up MERS-CoV leading to infection enhancement (Hui et al., 2020; Wan et al., 2020; Zhou et al., 2014). In contrast, neither SARS-CoV-1 nor SARS-CoV-2 productively infect macrophages (Bournazos et al., 2020; Hui et al., 2020; Yip et al., 2016). Importantly, a recent study demonstrated that alveolar macrophages harboring SARS-CoV-2 RNA produce T cell chemoattractants leading to T cell IFN-γ production that in turn, stimulates inflammatory cytokine release from alveolar macrophages (Grant et al., 2021). Why severe lung pathology and inflammatory cytokine production occurred in only 1 of 31 monkeys is unknown, but may relate to host-specific differences regulating inflammatory cytokine production (Bastard et al., 2020; Zhang et al., 2020). It is important to note that the one monkey that developed alveolar and perivascular edema and elevated BAL inflammatory cytokines could have been caused by antibody enhancement of disease, or could have been due to unknown factors that caused more severe disease in animal BB536A that were unrelated to DH1052 administration. That none of 6 animals infused with a higher dose (30mg/kg) of DH1052 did not have enhanced pulmonary disease supports the hypothesis that the lung pathology may have been a severe case of COVID-19 lung disease unrelated to antibody infusion.
In vitro enhancing antibodies may have the ability to suppress SARS-CoV-2 replication in vivo through non-neutralizing FcR-mediated antibody effector functions (Bournazos et al., 2020; Schafer et al., 2021). While circulating in vivo, antibodies can opsonize infected cells or virions and recruit effector immune cells to kill virus-infected cells through Fc-mediated mechanisms (Bournazos et al., 2020). A recent study in a SARS-CoV-2 mouse model of acquisition suggested that Fc effector functions contribute to the protective activity of SARS-CoV-2 neutralizing antibodies C104, C002, and C110 (Schafer et al., 2021). Thus, antibody effector functions may contribute to the outcome in vivo, but not be accounted for in SARS-CoV-2 enhancement or neutralization assays in vitro. In support of this hypothesis, infection-enhancing, non-neutralizing NTD antibody DH1052 reduced infectious virus titers in the lungs of challenged mice and monkeys compared to the negative control antibodies. Consistent with previous findings for human IgG (Dekkers et al., 2017), we have demonstrated that DH1052 antibody can bind to select murine FcγRs., raising the hypothesis that DH1052 Fc-mediated effector functions may be responsible for the reduction of virus replication. Future studies will investigate Fc-mediated effector functions of DH1052 to discern their role in reducing infectious SARS-CoV-2 virus titers in mice and monkeys.
Finally, administration of COVID-19 convalescent sera to over 35,000 COVID-19 patients have demonstrated the treatment to be safe and is not associated with enhanced disease (Joyner et al., 2020). Of greater importance is that both the Pfizer/BioNTech and Moderna mRNA-lipid nanoparticle (LNP) vaccine efficacy trials have completed and showed ∼95% vaccine efficacy (Jackson et al., 2020; Polack et al., 2020). That the Moderna mRNA-LNP COVID-19 vaccine efficacy trial had 30 severe cases of COVID-19 occur—all in the placebo group (Baden et al., 2020), demonstrated that if antibody-based enhancement of infection or lung pathology will occur in humans with vaccination, it will be rare. Finally, a recent study demonstrated that suboptimal neutralizing antibody level is a significant predictor of severity for SARS-CoV-2 (Garcia-Beltran et al., 2020). Thus, in spite of the rarity of severe lung pathology associated with presence of anti-spike antibody in animal model studies reported here, it will be important to continue to monitor on-going COVID-19 vaccine efficacy trials for the possibility of vaccine associated enhanced disease when suboptimal neutralizing antibody titers are induced (Haynes et al., 2020).
Что сделали авторы:
Поскольку известно, что ответ иммунитета поликлональный, и когда ему представлен целый микроорганизм, или хотя бы его белок (допустим), содержащий множественные антигенные эпитопы (небольшие участки этого белка, с которым специфические антитела свяжутся и подойдут как ключ к замку)- то в результате такой встречи будут вырабатываться разные антитела, к разным эпитопам (иногда заходящим друг на дружку участкам) белка, и у одного человека, и у разных людей, причем еще и в разном количестве. И, так же, сила связывания антител с этими эпитопами будет разная, и эффективность связывания (нейтрализация проникновения патогена в клетку) -тоже.
Так же, есть данные, что некоторые антитела, из производимых, для некоторых болезней, могут усиливать заражения клеток вирусом в эксперименте или при реальной инфекции. Эффект АЗУИ-антитело заивсимое усиление инфекции. Или АЗУВ (воспаления).
Авторы решили проверить, как будут работать антитела (группа примерно в 1700) переболевших, предположительно, похожих на выработавшиеся в результате иммунизации к шипиковому белку, в пробирке и на животной модели. Будут ли они эффективно помогать? будут ли усиливать инфекцию? Как вообще они себя видут на молекулярном и биофизичеком уровне, соединяясь с антигеном, есть ли между ними принципиальные отличия, чтобы можно было как то отличить, или повлиять, итп?
Из этой большой выборки отобрали 187 антител, теоретически "более рабочих", чтоб были к эпитопам шипика.
Среди 81 антител к РСЧ шипика (из этой выборки в 187), нейтрализующим действием обладали 44. То есть больше половины.
Авторы отобрали 100 разных антител IgG1 к шипику (не только к РСЧ), и проверили, могут ли они вызывать АЗУИ in vitro.
Под АЗУИ тут имеется ввиду прямое значение- проникать внутрь клетки, не содержащей основного рецептора АСЕ2 и нужной трансмембранной протеазыTMPRSS2, а через антительный рецептор, содержащейся на ней ( Fc receptor - FcγR (в нескольких видах- (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb or FcγRIII, он, обычно на иммунных клетках, помогающих утилизировать меченный антителом патоген. но через него вирус в составе комплекса АгАт может проникать в модельные клетки и размножаться там).
Таких оказалось три, связывающихся с FcγRI, и пять, соединяющихся с FcγRIIb. За проникновение в клетки были ответственны именно "рецепторные" части антител (Fc). Потом проверили, обладают ли эти "усиляющие инфекцию антитела к РСЧ- нейтрализующим эффектом. Оказлось- да.
Характерно, что все эти АЗУ-антитела были из группы к РСЧ шипика.
Так же авторы проверили 41 антитело к N(амино)-концу шипика коронавируса. Почему к нему? Думаю, потому что антитела при иммунизации могут образовывастья не только к РСЧ, а к S1 субъединице вируса, S2 и N-концу, и есть исследование, показавшее- что к амино-концу вырабатывается удивительно много антител (почему-то), 84%, и они, при этом, порой тоже обладают нейтрализующей активностью (мешают вирусу связываттся с АСЕ2).
Как выглядит шипик для антител
10 антител з 41 оказались способны нейтрализовать проникновение вируса (препятствовать соединению вируса с АСЕ2). Так же, в этой группе было 5 антител, не обладающих нейтрализирующим действием, но способствующим АЗУИ на культуре клеток. Интересно, что эти последние 5 антител могли проникать только в клетки с АСЕ2 рецепторами, в отсутствии FcγR - просто в присутствии этих антител заражаемость культур вирусом (при всех прочих равных) увеличивалась в полтора- три раза (почему-не совсем понятно, но, возможно, связывание с антителом как то улучшало конформацию и облегчало связываение с АСЕ2 или работу протеазы).
Часть из антител к N-концу тоже оказалась способной вызывать АЗУИ с использованием Fc.
По антителам к РСЧ- они могли обладать нейтрализующим эффектом, усиляющим инфекцию эффектом, или обоими сразу.
Для антител к N-концу : они обладали либо нейтрализующим, либо АЗУ эффектом.
Далее авторы сравнили "усиляющие инфекцию" нейтрализующие антитела к РСЧ, и просто нетрализующие антитела к РСЧ. Оказалось, что они не отличаются ни по силе связывания (афинность), ни по местам связывания (эпитопы), ни по блокировке зон. Геометрически, они тоже связывались примерно одинаково (вертикально, параллельно оси тримера S белка). Блокировка РСЧ у некоторых антител была просто потому, что они физически перекрывали РСЧ, а у других- нет (визуально РСЧ был свободен).
Небольшая разница, можно сказать была только в том, что- нейтрализующие антитела своими "хвостами" (что связываются с рецептором иммунной клетки) были чаще направлены в сторону от вирусной оболочки, а "усиляющие"- слегка в сторону вируса. Но не все. В целом же, среди всех антител с потенциалом АЗУ, их рецепторные хвосты чаще были направлены в сторону вируса.
Любопытно, что часть из этих РСЧ антител реагировала перекрестно и с РСЧ вируса САРС1, и летучих мышей, и панголина.
По антителам к N-концу- они обладали чуть более сильной афинностью, особенно одно из усиляющих заражение.
И 5 из них, как оказалось, обладали вполне эффективной нейтрализующей активностью: не смотря на то, что вроде бы и не к РСЧ, тем не менее, в ними, сидящими на шипике, вирус не мог соединиться с АСЕ2.
Так же, авторы проверили- а не мешают ли все эти антитела друг другу. Выяснилось, что не особо. Если есть разные антитела, то будут садиться каждый на свой участок, и все. Если вместе с нейтрализующим(и) сядет и антитело для АЗУ - эффект АЗУ может реализоваться. На 1 шипик может "напасть" сразу несколько нейтрализующих антител.
Будет ли "предпочтение" при связывании? Например, если есть просто нейтрализующие IgG, и нейтрализующие с эффектом АЗУ - то вдруг вторые окажутся резвее?
Нет, процесс вероятностный, тк все прочие у них примерно одинаковые. А так, чтоб "доминировали" нейтрализующие IgG с эффектом АЗУ (ну и приводили к дальнейшей патологии)- и гарантирваоно заняли место на шипике, то их должно быть в системе, примерно в 1000 раз больше, чем других, как покаазло моделирование in vitro.
Что, в общем, не может не обнадеживать.
Потому что смотрим- из 187 типов антител IgG, только 15 оказались способными на АЗУИ. А нейтрализующим эффектом обладали 54 антитела.
Авторы пошли дальше.
Они взяли антитела, которые обладают способностью к АЗУИ, наразмножали их, и ввели животным. В таких количествах, чтобы "сымитировать" натуральный иммунитет, который мог бы возникнуть с эфектом АЗУ у привитых.
Чтобы проверить, на сколько ситуация in vivо будет похожа на in vitro.
Как модели они использовали стареющих мышей, которых заразили модифицирванным под них коронавирусом САРС2, и макак, для котрых подошел обычный штамм.
Оказалось, что мыши, у которых были высокие концентрации антитела N-концу с потенциалом АЗУИ, введенного за 12 часов до инфекции, болели точно так же (по симптомам), как и мыши без этих антител (контролю вводили антитела против гриппа).
Опытные мыши очищались от вируса быстрее, у них было меньше повреждений в легких, меньше вирусной РНК в легких, и выживали лучше ( в контроле умерло 2 мышки из 9 на 4 день, когда проверяли что там с легкими, а в опыте все были 10 живы). Так что даже не-нейтрализующее антитело к N-концу шипикового белка помогло им справляться с инфекцией, и не проявило свою способность к АЗУИ на животной модели.
Далее, это же антитело проверили на макаках (заразили интраназально на 3 день после введения антител), притом сравнили и с положительным контролем- которому ввели другое антитело N-концу шипика, обладающее только нейтрализующим эффектом.
У макак взяли кровь, определили, что титр человеческих антител к коронавирусу на 2 день был приличный (11 to 238 μg/mL). Болезнь у 4 макак с АЗУ-антителом протекала так же, как и у контроля (просто зараженных ковидом, с антителом к гриппу). А у одной было тяжелое течение.
То есть, в 20% наблюдались патологичсекие реакции в легких (отечность, повышенные количества макрофагов М2 типа и цитокинов), но поскольку у них обнаружилась макака с подобными проявлениями и в контрольной группе (где был просто ковид, а антител к коронавирусу не вводили), то авторы относят призошедшее к редкой индивидуальной реакции (хотя я б не была так уверенна).
У всех макак, которые получили просто нейтрализующее антитело, было меньше поражений в легких, и меньше вирусной РНК в образцах. АЗУ-антитело к них, в отличие от мышей, не показало особой эффективности против вируса.
Чтобы проверить, нет ли тут дозозависимости, группе макак ввели и в 3 раза повышенную дозу тех же АЗУ-антител. Отрицательных эффектов вроде АЗУ отмечено не было, зато эта доза антител уже подавляла вирус в мазках и выделениях. Только картина течения болезни была все такая же- как и в контроле, и при более низкой дозе АЗУ-антител.
Так что авторы сделали вывод, что такие антитела не проявляют свой потенциал к АЗУ (доказанный in vitro) при реальной болезни. Так что не стоит его опасаться.
Далее авторы проверили подобным образом и АЗУ-антитела к РСЧ. Они введили годовалым мышкам нейтрализующее антитело к РСЧ, или нейтрализующее антитело к РСЧ с АЗУ потенциалом, или даже оба этих антитела вместе.
Результат вышел выше всех похвал- мышки болели слабо-выраженно, поражения в легких были минимальные, и вообще, вируса было мало, а у некоторых через 2 суток вообще в легких не определялся. Единственное, думаю, что 2 дня после инфекции это было рановато все смотреть в легких- лучше б было 4, как в предыдущем варианте, и мне не совсем понятна логика.
Потом авторы проверили (на мышках же) нейтрализирующие АЗУ-антитела к РСЧ, которые показали кросс-реактивность с другими коронавирусами, и способность проникать в клетку через FcγR (на культуре клеток). Они вводили им эти антитела за 12 часов до инфекции мышиным вариантом ковида, или 12 часов после.
Те, кому ввели антитела до заражения- показали чистые легкие, а у контроля легкие были завирушены. Если антитела вводились после инфекции- то в зависимости от вида антитела они снижали завирушенность легких в 2-10 раз. АЗУ-потенциал этих антител не реализовался на мышиной модели, а наоборт, они показали свое защитное действие.
Все нейтрализующие АЗУ-антитела, проверенные на мышках (4 вида) к РСЧ проверили так же и на макаках. Через 2 дня после введения человеческих антител (10 мкг на кг) их уровни в крови макак были 11 -228 μg/mL.
Нейтрализирующий эффект присутствовал, и широко вариьировал. 3 типа антител показали защитный эффект ( у животных было меньше поражений в легких, и мало вирусной РНК в верхних инижних дыхательных путях, по сравнению с контролем). Одно из антител (более слабое с точки зрения нейтрализации in vitro)- не повлияло на количество вируса, но защитный эффект тоже был у части макак. 3 из этой группы имели поражения в легких такого же уровня или более, как и контроль (без нейтрализующих антител к коронавирусу). У этих макак были инфильтрации макфроагов в легкие, но не было поражений сосудов в легких, и было чуть меньше вируса. В общем, у 2 была пневмония, у одной ТОРС.
Но это 3 макаки из 31, и, возможно, такая реакция поясняется их индивидуальными особенностями- тк вируса у них в системе все же было обнаружено меньше, чем в контроле.
Так что, с точки зрения авторов- даже антитела, показывающие АЗУ-потенциал в пробирке, в организме, скорее всего, проявят себя именно как защитники- в большинстве случаев они нейтрализуют вирус эффективно, и уменьшают симптомы болезни.
С моей колокольни- все же, у них в эксперименте реализовался шанс, для некоторых из этих АЗУ-антител. На макаках в одной серии ( с АЗУ-антителом камино-концу шипика)- 20%, в другой (с АЗУ-антителом к РСЧ) - если брать всю группу в 31 животное- то это 7% среднетяжелой (пневмония, наверное-не запущенная) и 3%- ТОРС.
Методика там где-то отдельно,потому точное время, когда все это наблюдалось-проверялось у макак, не скажу.
Только вот в отличие от болезни и естественного иммунитета- который будет усиливаться по ходу повторного столкновения с антигеном (тк будут активироваться клетки, производящие антитела и цитокины)- введенные человеческие антитела со временем просто вымываются, и сами по себе, и ввиду Ат-Аг реакций и дальнейшего фагоцитоза.Так что в реале может быть несколько другая картина при инфекции, чем у обезьян.
Так же, средне-тяжелые и тяжелые случаи ковида (когда есть поражения легких игоспитализация)- тоже где то около 10%, и среди всех случаев, критические и тяжелые- тоже не то чтобы большой % (если предположить что результат смерть- то 2%, в среднем). Так что это все цифры на животных- похожих порядков, и может быть, как раз реализация вероятности АЗУ, в том числе.
Возможно, авторы словили и не АЗУИ, а АЗУВ (воспаления)- ведь одни животные, все же, болели тяжелее других. А группы не слишком велики.
Разумеется, индивидуальные особенности иммунитета важны, но и я так вижу, что иногда шанс на АЗУ на животной модели может реализоваться (хоть и не так гарантированно, как в пробирке).
При этом - не забываем о главном результате работы- что антитела, даже с АЗУ потенциалом, борются с вирусом, и гуморальный иммунитет к коронавирусу помогает, примерно в 90% случаев.
Абстракт
SARS-CoV-2 neutralizing antibodies (NAbs) protect against COVID-19. A concern regarding SARS-CoV-2 antibodies is whether they mediate disease enhancement. Here, we isolated NAbs against the receptor-binding domain (RBD) and the N-terminal domain (NTD) of SARS-CoV-2 spike from individuals with acute or convalescent SARS-CoV-2 or a history of SARS-CoV-1 infection. Cryo-electron microscopy of RBD and NTD antibodies demonstrated function-specific modes of binding. Select RBD NAbs also demonstrated Fc receptor-γ (FcγR)-mediated enhancement of virus infection in vitro, while five non-neutralizing NTD antibodies mediated FcγR-independent in vitro infection enhancement. However, both types of infection-enhancing antibodies protected from SARS-CoV-2 replication in monkeys and mice. Nonetheless, three of 31 monkeys infused with enhancing antibodies had higher lung inflammation scores compared to controls. One monkey had alveolar edema and elevated bronchoalveolar lavage inflammatory cytokines. Thus, while in vitro antibody-enhanced infection does not necessarily herald enhanced infection in vivo, increased lung inflammation can occur in SARS-CoV-2 antibody-infused macaques.
Дискуссия:
Here, we demonstrated SARS-CoV-2 RBD and NTD antibodies can increase infection in vitro, but either protect or do not increase coronavirus replication in mouse and monkey models in vivo. However, increased lung inflammation was observed infrequently in SARS-CoV-2 antibody-treated macaques despite having low or undetectable lung viral antigen. In three of 31 monkeys administered RBD or NTD antibodies that mediated infection enhancement in vitro, lung inflammation scores were greater than in control IgG-infused monkeys. One of these three macaques had alveolar edema and elevated BAL cytokine levels compatible with acute respiratory syndrome, while the other two monkeys with high lung inflammation scores did not show edema nor BAL inflammatory cytokines. Thus, only one antibody-infused monkey had severe lung inflammation.
Notably, we observed two different types of in vitro infection enhancement. First, RBD antibodies mediated classical antibody-dependent enhancement that required FcγRs and antibody Fc for virus uptake (Lee et al., 2020). Previous studies have demonstrated that uptake of MERS-CoV or SARS-CoV has mostly been mediated by FcγRIIa on the surface of macrophages (Bournazos et al., 2020; Wan et al., 2020; Yip et al., 2016). In contrast to SARS-CoV and MERS-CoV infection enhancing antibodies, we identified SARS-CoV-2 RBD antibodies utilized FcγRIIb or FcγRI. Thus, different FcγRs can mediate SARS-CoV and MERS-CoV in vitro infection enhancement compared to SARS-CoV-2 in vitro infection enhancement. Second, non-neutralizing NTD antibodies mediated FcγR-independent infection enhancement in two different FcγR-negative, ACE2-expressing cell types. The mechanism of FcγR-negative in vitro enhancement remains unclear, but one hypothesis is the possibility of antibody modulation of S protein conformation because of the requirement for ACE2 expression on target cells. In NSEM studies, NTD antibodies preferentially bound to S in a 3-RBD-down conformation. One study has reported that binding of select NTD antibodies to S enhances S binding to ACE2 (Liu et al., 2020b). Whether S protein has different entry kinetics or higher affinity for ACE-2 when liganded to infection-enhancing antibody DH1052 will be a focus of future studies.
Previous studies with vaccine-induced antibodies against SARS-CoV-1 have also shown in vitro FcγRII-dependent infection enhancement, but no in vivo infection enhancement in hamsters (Kam et al., 2007). Macrophages and other phagocytes are the target cells that take up MERS-CoV leading to infection enhancement (Hui et al., 2020; Wan et al., 2020; Zhou et al., 2014). In contrast, neither SARS-CoV-1 nor SARS-CoV-2 productively infect macrophages (Bournazos et al., 2020; Hui et al., 2020; Yip et al., 2016). Importantly, a recent study demonstrated that alveolar macrophages harboring SARS-CoV-2 RNA produce T cell chemoattractants leading to T cell IFN-γ production that in turn, stimulates inflammatory cytokine release from alveolar macrophages (Grant et al., 2021). Why severe lung pathology and inflammatory cytokine production occurred in only 1 of 31 monkeys is unknown, but may relate to host-specific differences regulating inflammatory cytokine production (Bastard et al., 2020; Zhang et al., 2020). It is important to note that the one monkey that developed alveolar and perivascular edema and elevated BAL inflammatory cytokines could have been caused by antibody enhancement of disease, or could have been due to unknown factors that caused more severe disease in animal BB536A that were unrelated to DH1052 administration. That none of 6 animals infused with a higher dose (30mg/kg) of DH1052 did not have enhanced pulmonary disease supports the hypothesis that the lung pathology may have been a severe case of COVID-19 lung disease unrelated to antibody infusion.
In vitro enhancing antibodies may have the ability to suppress SARS-CoV-2 replication in vivo through non-neutralizing FcR-mediated antibody effector functions (Bournazos et al., 2020; Schafer et al., 2021). While circulating in vivo, antibodies can opsonize infected cells or virions and recruit effector immune cells to kill virus-infected cells through Fc-mediated mechanisms (Bournazos et al., 2020). A recent study in a SARS-CoV-2 mouse model of acquisition suggested that Fc effector functions contribute to the protective activity of SARS-CoV-2 neutralizing antibodies C104, C002, and C110 (Schafer et al., 2021). Thus, antibody effector functions may contribute to the outcome in vivo, but not be accounted for in SARS-CoV-2 enhancement or neutralization assays in vitro. In support of this hypothesis, infection-enhancing, non-neutralizing NTD antibody DH1052 reduced infectious virus titers in the lungs of challenged mice and monkeys compared to the negative control antibodies. Consistent with previous findings for human IgG (Dekkers et al., 2017), we have demonstrated that DH1052 antibody can bind to select murine FcγRs., raising the hypothesis that DH1052 Fc-mediated effector functions may be responsible for the reduction of virus replication. Future studies will investigate Fc-mediated effector functions of DH1052 to discern their role in reducing infectious SARS-CoV-2 virus titers in mice and monkeys.
Finally, administration of COVID-19 convalescent sera to over 35,000 COVID-19 patients have demonstrated the treatment to be safe and is not associated with enhanced disease (Joyner et al., 2020). Of greater importance is that both the Pfizer/BioNTech and Moderna mRNA-lipid nanoparticle (LNP) vaccine efficacy trials have completed and showed ∼95% vaccine efficacy (Jackson et al., 2020; Polack et al., 2020). That the Moderna mRNA-LNP COVID-19 vaccine efficacy trial had 30 severe cases of COVID-19 occur—all in the placebo group (Baden et al., 2020), demonstrated that if antibody-based enhancement of infection or lung pathology will occur in humans with vaccination, it will be rare. Finally, a recent study demonstrated that suboptimal neutralizing antibody level is a significant predictor of severity for SARS-CoV-2 (Garcia-Beltran et al., 2020). Thus, in spite of the rarity of severe lung pathology associated with presence of anti-spike antibody in animal model studies reported here, it will be important to continue to monitor on-going COVID-19 vaccine efficacy trials for the possibility of vaccine associated enhanced disease when suboptimal neutralizing antibody titers are induced (Haynes et al., 2020).
![[community profile]](https://www.dreamwidth.org/img/silk/identity/community.png){kind=small}